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超先鋭研究プログラム

研究内容紹介

[2016年]

「神聖なる好塩性アーキアのスクリーニング!」

峯岸 宏明 外来研究員

紹介を始める前に、、、

「研究内容紹介シリーズ 」第2回目も、引き続きテーマは「培養

今回の著者 峯岸氏は好塩菌をこよなく愛する?好塩菌スクリーニング(培養)のスペシャリスト!どのくらいかと言われれば、、、 好塩菌wikiの執筆をしていたり、本原稿の執筆依頼の際に図表入れてA4サイズ2、3ページ分とのお願いに以下の文量が寄稿されて来るくらいで、この紹介文を読み終わった頃には、
みなさまにもスペシャルっぷりが伝わるかと、、、(汗)

注意! 文中にネタが多過ぎて編集者が注釈拾いきれません。んっ?と思った方は該当箇所のフレーズ等で検索してください。



皆様初めまして、「何かが足りない」、「おしい」と一部から言われている居候研究員(外来研究員)の峯岸宏明です。 「お主は誰じゃ?」と思っている人は、このページの左側にある「メンバー」をクリック、または海洋生命理工学研究開発センターの「メンバー」ページ見るか、ググってください。

 日本における好塩性アーキアの研究分野(主に系統解析なのか?)に(赤い彗星のごとく現れた私ですが、今回は「研究内容紹介シリーズ -テーマ培養- 」ということで、真面目に一般的な微生物と好塩性アーキアの分離方法(スクリーニング)について説明させて頂きます。手法というよりは、どのように妄想を繰り広げてスクリーニングをするのかという説明です。

深海・地殻内生物圏研究分野、好塩性アーキア関係ないじゃんと思われる人もいるかとは思いますが、

海洋研究開発機構(JAMSTEC)→海の研究→海→塩→好塩菌

つまりJAMSTECは好塩菌を研究するための研究機関と言っても過言ではないのです。好塩菌のクローンも一応、居酒屋ではないチムニーから見つかっています!(文献1、英語論文)

また、図を書いたり引用したりするのが面倒だったので、100%文章です。 HP担当の方が、見やすく色をつけてくれたり、適当な図を差し込んでくれたりすることを心から祈っておる次第です。
I really appreciate your help, I couldn’t have done it without you.
先にお礼言っておきます。
編集者註:ムリっ!という事でみなさま、「安心して下さい!!」「(図は)入ってますよ!」、とついでに今回のフォント色や強調などは著者の原文のまま未編集でお楽しみください。)

 
 

一般的なカスい微生物のスクリーニング

 微生物のスクリーニングとは、自然環境中から目的とする微生物を探索することを言います。どのように行うかというと、まぁ、そこら辺で売っている適当な参考書でも読んどけや!でてこいや!

と、言いたいところですが、このスクリーニングというものは非常に難しいので、少しだけお話します。

ただ単に、土壌や海水から微生物を分離するだけであれば、そこら辺でゼリーでも買ってきて、その上に土壌や海水を散布し、適温に置いておけば、いつの日か何かしらの未知(既知?)なる微生物がコロニー(微生物の集落)を作ります(良い子はまねしないでね!)。食パンやお餅を部屋に放置するのもOK。

OKではありません。

あくまでもスクリーニングは「目的とする微生物を探索すること」なので、実際には様々な事を考慮しなければいけません。

例えば、栄養源(エネルギー源、炭素源、無機塩類、窒素、ビタミンなど)、温度、pH、酸素、その他にも光や圧力など、目的とする微生物が好みそうな環境を考えなければいけません。また、我々が想像もつかないものが必要な場合があるかもしれません。


しかしながら、これら全て考慮することは高井分野長レベルでもほぼ不可能(もしかしたらできているかも)、峯岸居候研究員ではほぼ完全に不可能なので、ここではスクリーニングを行う際に重要な要因となる栄養源、温度、pHに関して説明したいと思います。あとは面倒なので省略します。それこそ参考書でも読んでください。


おすすめは、

※これらの本にはスクリーニング関する内容が記載されていない可能性が大いにあります。


  • 栄養源
    (微)生物は求める栄養源の種類によって分類することが出来ます。
    エネルギー源の分類としては、光をエネルギー源とする光合成生物(phototroph)、化学エネルギーに依存する化学合成生物(chemotroph)に分けられます。一方で、炭素源による分類としては二酸化炭素のような無機化合物を炭素源として利用できる独立栄養生物(autotroph)、有機物を利用する従属栄養生物(heterotroph)に分けられます。これらの組み合わせによって、以下の様にまとめることが出来ます。

     光合成独立栄養生物(photo-auto-troph)
     光合成従属栄養生物(photo-hetero-troph)
     化学合成独立栄養生物(chemo-auto-troph)
     化学合成従属栄養生物(chemo-hetero-troph)

    そもそも混合栄養生物(mixotroph)も存在するので、栄養源による厳密な定義はありません。

    その他にも、タンパク質、アミノ酸、核酸などの窒素化合物の原料となる窒素源やリン、硫黄、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなどの無機塩類も生物にとって必須です。

    スクリーニングを行う上で、これら栄養源つまり培地組成を考えることは最も重要なポイントの一つです。

    天然物由来の栄養源として、各種ペプトン、酵母エキスなどが実験でよく使われます。酵母エキスは焼き肉のタレなどに含まれているから我々にとって身近なものです。

    「♩もしかしてだけど〜×2、化学合成従属栄養生物のスクリーニングには焼き肉のタレが使えるんじゃないの。♩」と、常日頃?思っていますが、実際には使ったことはありません。


  • 温度
     温度は生体内における化学反応に最も影響を与えるものです。そのため、微生物分離の際の温度決定は非常に重要なものとなってきます。

    微生物は最適増殖温度条件により、以下の様に分類できます(厳密な定義ではない)。

    • 好冷菌:0℃付近に最適条件を持ち、20℃以上では増殖できない。
    • 中温菌:20-45℃に最適条件。「ぬるま湯に浸かってんじゃねぇよお前!!」
    • 好熱菌:45-60℃に最適条件。「もっと熱くなれよ!」
    • 高度好熱菌:60-80℃に最適条件。「あきらめんなよ!」
    • 超好熱菌:80℃以上に最適条件。「崖っぷちありがとう」

    現在、最も高温で増殖可能な正式に名前がついている微生物は我らが分野長Ken Takai氏によるMathanopyrus kandleriというメタン菌。加圧条件下で122℃もの高温で増殖可能。詳しくは論文を見てね

     同じ培地組成でも培養温度を変えるだけで、増殖してくる微生物の種類は大きく異なります。詳しい事は崇高なる好熱菌の研究者の方々にお問い合わせ下さい。


  • pH(水素イオン濃度)
     一般的に微生物はそれぞれ限られたpH範囲で増殖します。これについても厳密な定義はありませんが、以下の様に分類されます。

    • 好中菌:pH 5-9に最適増殖を示す。
    • 好酸菌:pH 5以下に最適増殖を示す。
    • 好アルカリ菌:pH 9以上に最適増殖を示す。

    2001年までは好塩性アーキアのNatronobacterium gregoryi が最も高いpHで生育可能な微生物でしたが、「新発見をしたときはアメリカ国歌が、深海へ潜るときは映画『トップガン』のテーマ曲が頭の中で流れる」人物によりAlkaliphilus transvaalensis が発見され[文献、英語論文]、その座を奪われました。



 このように、様々な要因を考慮に入れて我々研究者は微生物のスクリーニングを行っていますが、地球上に存在する微生物のほとんどが難培養、未培養です。難培養、未培養な微生物を獲得するには、未知なる物質(○ノフスキー粒子、しめつけ○○ビーム、宇宙一堅いと言われているカッ○ン鋼など?)の発見も必要かもしれません。


 では実際にどのようにスクリーニングするかというと、一般的には固体または液体培地をつくって、そこにスクリーニング試料をいれます。培地作りは微生物のご飯作り、究極または至高のメニュー作りなのです。

本日のお料理は、『和風微生物分離培地』です。

水1Lに、
固形出汁(栄養源)2粒、
塩 少々、
寒天を15〜20 g入れます。

これを高圧釜で121℃、20分間処理します。
すこし、冷まして型に入れれば、完成です。

液体がお好みの場合は、寒天を除いてください。
また、アルカリがお好みの方はアルカリ成分(重曹的な物)を別にして、高圧釜で煮てください。

的なノリで、作ります(あながち本当)。


その後、スクリーニング試料を塗布し、適温で数日間放っておきます。すると微生物コロニーが出てきます。たまに放置しすぎて、忘れてしまうことがあるので、型(シャーレ)にはちゃんと名前を書いておきましょう。名前を書いて管理しておかないと「このばいちを作ったのは誰だあっ!!」と怒られてしまうので注意しましょう。
そして、上記のレシピ?を見て実際に分離されても、我々は一切の責任を負わないことをご承知ください

 

神聖なる好塩性アーキアのスクリーニング

「一般的なカスい微生物のスクリーニング」の項で、栄養源、温度、pHについて説明してきましたが、塩(NaCl)濃度も微生物にとって重要なファクターです。NaClって無機塩類に含まれているじゃん、とお気づきの方は目を瞑っておいてください。

では、一般的な微生物と好塩性アーキアは何が違うのか。そう、読んで字の如く、兎に角こやつらは塩が好きなのです。

どれくらい好きかというと、
「○西先生・・・!!」「・・・・・・・・・・・・」「バスケがしたいです・・・・・」
ぐらい好きで、塩がないと生きていけないのです。

そもそも、ほとんどの生物は塩が無いと生きていけません。微生物は増殖最適塩濃度によっても分類されています。

  •  非好塩菌:増殖最適NaCl濃度  0-0.2 M
  • 低度好塩菌:増殖最適NaCl濃度 0.2-0.5 M
  • 中度好塩菌:増殖最適NaCl濃度 0.5-2.5 M
  • 高度好塩菌:増殖最適NaCl濃度 2.5-5.2 M


好塩性アーキアはこの分類では高度好塩菌に属するストイックな奴らです。

さらには、好塩性アーキアはウーズさんによる3ドメイン説のアーキアドメインでは最大数を誇っています。その数は50属200種を超えるアーキア最大派閥、与党なのです。いくら好熱菌やメタン菌が束になっても適わないのです(種類だけは)。

研究者の数は野党です(たぶん)。

また、古事記にあるように、黄泉国から戻った伊邪那岐命(イザナギノミコト)は自らの体についたけがれをはらうために、海水で禊祓(みそぎばらい)をし、さらに『旧約聖書』には、預言者エリシャが悪しき水の水源に塩をまくと、たちまち水が清らかとなり、死も流産も起こらなくなったことが記されています。このように「塩」は昔から清めに用いられてきたこともあり、その中に生息する好塩性アーキアはまさに神聖なる微生物であると言えるのです。

 神聖なる好塩性アーキアは極限微生物の一種です。極限環境とはヒトや一般的な動植物が生息できないような環境を指し、その条件として、高温、低温、高pH、低pH、高NaCl濃度、高圧力、有機溶媒、放射線などがあります。また、それぞれに対応する微生物も地球上には数多く存在します。先程紹介した好熱菌や好アルカリ性菌も勿論、極限環境微生物です。


また、これら複数の条件で増殖できる(微)生物をPolyextremophiles と言います。
例えば、好熱好アルカリ性菌のThermococcus alcaliphilus や、好冷好圧性菌のShewanella violacea などです。

しかしながら、高NaCl濃度下で増殖できる微生物はほんのちょっとの例外を除いて好塩性アーキアしか見つかっていません。高NaCl濃度下では自称極限生物のクマムシだって、どうにもならず干からびているだけなのです。


好塩性を制する物は世界を制す。


そうまさに、好塩性アーキアこそPolyextremophiles の代表なのです。好塩性アーキアは様々な極限環境因子を好む/耐えるのです。

  • 好熱好塩菌
    60℃くらいなら生えるよ。そのうちもっとすごいのがとれるはず(希望)。だって、好塩菌の酵素は耐熱性の物が多いし。

  • 好冷好塩菌
    Halorubrum lacusprofudi は4℃で増殖。もっと低温を好むやつもいる(希望)。

  • 好酸性好塩菌
    我らがHalarchaeum acidiphilum。好塩性アーキアで初めての好酸性菌。 准1031峯岸により分離された[文献、英語論文]。もっと、低pHを好むやつもいるよ(きっと)。

  •  
     
    図1、Halarchaeum acidiphilum MH1-52-1の顕微鏡写真。平板三角形状をしている。株名のMHは筆者のイニシャル。
    その当時は日本人的発想でMHにしたが、HMにしなかったことを未だに後悔している。、、、、、やっぱりファーストネームが先でしょ。


  • 好アルカリ性好塩菌
    再度登場、Natronobacterium gregoryi詳しくは上部リンクで↑。

  • 好圧性好塩菌
    瞬間圧力300 MPaぐらいに耐えるやつがいるらしい(論文あり)。未発表だが50 MPaで増殖可能なものを数株保有しています(培地組成等はひ・み・つ)。

  • 耐有機溶媒好塩菌
    好塩菌の酵素は有機溶媒に強いらしいよ。菌自体も強いといいね。

  • 耐放射線好塩菌
    放射線に耐える奇妙な果実 Deinococcus radiodurans に匹敵するHalobacterium salinarum NRC-1様。

では、このような好塩性アーキアはどのようにスクリーニングしたらいいのでしょうか? 簡単に言えば、一般微生物用の培地に塩を大量(大体200 g/Lぐらい)にぶち込むだけです。そして人肌で1〜4週間程温めてあげれば、固体培地上にシャ○専用の様な赤いコロニーが出てきます。

 
 
図2、培地1リットルに入れるNaClの量。(左)一般微生物(右)好塩性アーキア。
メモリをぴったりにするのに20分かかった。


好塩性アーキアの培地は塩濃度が非常に高いため、長期間保存しておくと乾燥して塩濃度が上がって、塩が析出します。このような状態の培地ではさすがの好塩性アーキアもコロニーを作りにくくなります。

例えば、ここに
好塩性アーキア培地(横須賀本部で作ったもの)、好塩性アーキア培地(高知コアセンターで作ったもの)、塩を入れ忘れた培地の3種類があるとします。
好塩性アーキアは○岡さんのように、これらを見分けることが出来ます。

「ワインと豆腐と培地には旅をさせちゃいけない、そこに書いた通りですよ。」

「塩を入れ忘れた培地は問題外、高知コアセンターで作った培地は、高知から横須賀に運んできた分、少し乾燥が進んでいる。」

そう、好塩菌の培地は乾燥するとすぐに塩が培地表面に析出するので、作りたてほやほやを使用するのがベストなのです。

そもそもスクリーニング時の培養において、長い時は一ヶ月以上かかるので、古い培地はすぐに使い物にならなくなります(一般微生物の培地でもそうですが)。また、これは経験的にですが、好塩性アーキアの中には固体培地でコロニーを形成するのが苦手なものが多い気がします。液体培地のほうが増殖はいいです。また、好塩菌は培養条件や時期によって菌体の色が良く変わるので、コンタミしているかどうかの判断が非常に難しく、スクリーニング後の単離操作が非常に困難なことが多いです。菌株保存機関に保存されている物でさえ、コンタミしていることが良くあります。固体培地で培養して、2ヶ月後に別の好塩性アーキアのコロニーが出現することなどもあります。どこに隠れていたのやら。

好塩性アーキアは簡単に培養できるけど、何気に扱いが難しいのです。


どのようにスクリーニングするかは上述のような感じですが、では好塩性アーキアはどこにいるのでしょうか?

これらの多くは、岩塩、天日塩、塩湖などに存在します。

ファミレス等で塩の入った瓶にお米粒が入っている事があります。これは湿気から塩を守るために入っているわけですが、ちょっと高級なお塩にお米粒を入れると大変なことになります。

 
 
図3、好塩性アーキアの赤いコロニー


これはシャーレに、超?高級な塩を敷き詰め、そこにお米粒を数粒おいて、1ヶ月程適温に放置したものです。赤く見えるのが好塩性アーキアです。

天日塩の中にいるわけですから、我々も少なくとも少量は口にしている可能性があります。

「HEY! 安心して下さい。溶けてますよ。」

好塩性アーキアは塩が大好きなので、低塩濃度になると、その形を維持できなくなり死んでしまいます。だから、口に入れた時点で、壊滅状態です。


好塩性アーキアは我々に最も身近なアーキアなのです。ヒトは好塩性アーキアと共に育ってきたと言っても過言ではないでしょう。

 

余談

「生命の起源」を知るためには、まず「生命とはなにか」を明らかにしなければなりません。(略)そして、その問題を解決するかもしれないと期待されているのが地球外生命の探索です。

最近、地球外生命が存在する可能性がある星として、火星、準惑星のケレス、木星の衛星エウロパ、土星の衛星エンセラドゥスなどが、ニュースやインターネットを通じて、話題になっています。

これらに共通するものが皆さんは何かご存じでしょうか?

そう「塩」です(他にもありますが)。

つまりは、地球外生命として、好塩菌(地球にいるのと同じとは限らない)の存在が示唆されているようなものなのです。

生命の起源を知るためにも、地球外生命の探索においても好塩菌を無視することはできない時代がやってきたのです。

再度繰り返そう、「好塩性を制する物は世界(宇宙)を制す。」


最後に
 微生物のスクリーニングはとても重要な研究です。私個人の考えとしては、我々人間が想像できる範囲程度であればどんな場所にも生物(生物・生命の定義とか難しい事は考えずに直感的に生物と思えるもの)がいると考えます。マグマの中、宇宙にだっていると思います。いることを信じて日々、研究を重ねることが大事なのです。

「あきらめたらそこで試合終了ですよ・・・?」

「あきらめんなよ、あきらめんなよお前!どうしてそこでやめるんだ、そこで!もう少し頑張ってみろよ!ダメダメダメダメ諦めたら。周りの事思えよ、応援してくれる人達の事思ってみろって。あともうちょっとのところなんだから。俺だってこの-10℃のところ、好塩菌がトゥルルって頑張ってんだよ!ずっとやってみろ!必ず目標を達成できる!だからこそNever give up!!」

「頑張れ!頑張れ!できる、できる絶対出来る、頑張れ、もっとやれるって!やれる気持ちの問題だ。頑張れ頑張れ、そこだ!そこで諦めんな絶対に頑張れ、積極的にポジティブに頑張る頑張る!峯岸だって頑張ってるんだから!」

とは能く言ったものです。

あきらめない心を持ち続ければ、未知なる微生物も分離培養できます。

長文おつきあい有り難うございました。
Arri, Arri, Arri, Arri, Arrivederci(さよならだ)!!



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研究内容紹介を読んでみて Q&A


★なんか全体的に露骨に
稀代の微生物ハンター=高井分野長の持ち上げが
展開されてますけど、ファンなの?追っかけなの?
それとも就職活動なの?

    某家具屋団体ほどの追っかけぶりは発揮できませんが、
    高井さんの生き様を勉強しています。
    某団体について書くと調子に乗りそうなのでこれ以上は言及しませんが。
    就職活動なんて、まさかそんなこと・・・・・・・・

    よろしくお願いします。お買い得ですよ!!

★微生物スクリーニングの「栄養塩」のところに
山本研究員が全力で解説した
「電気」や「電気合成生物」が入っていないのは、編集長の責任ですね。
こういうさりげない編集が記事のグレードを左右するんすよ。決して「グレネードランチャーおみまいしたろか?お?」というわけではないですけど。

    著者:
    本当はもう少し書きたかったのですが、
    JAMSTECのサーバ用量が心配なので、そこは出来る男・山本さんに
    全てをおまかせした次第です。

    編集者:
    安心して下さい。この後に考えていますよ!(キリッ)、、、たぶん?

★未知なる物質(○ノフスキー粒子、しめつけ○○ビーム、宇宙一堅いと言われているカッ○ン鋼など?)のネタが一つもわからないのは、ジェネレーションギャップなの?
それとも著者がアホなの?

    むりやりネタをぶっ込むためにgoogle先生に尋ねてみました。
    ジェネレーションギャップではありません。
    著者がアホな訳でもありません、たぶん

★名前を書いて管理しておかないと「このばいちを作ったのは誰だあっ!!」と怒られてしまうので注意しましょう。 はフイタ。

    美○しんぼ全巻読破は伊達じゃないですよ。

★非好塩菌:増殖最適NaCl濃度  0-0.2 M
低度好塩菌:増殖最適NaCl濃度 0.2-0.5 M
中度好塩菌:増殖最適NaCl濃度 0.5-2.5 M
高度好塩菌:増殖最適NaCl濃度 2.5-5.2 M
というところを重量%に変換してあげる優しさが
女性にもてる秘訣です。

    非好塩菌:
    増殖最適NaCl濃度  0-0.2 M(0-1.17%)・・・・・いい塩梅

    低度好塩菌:
    増殖最適NaCl濃度 0.2-0.5 M (1.17-2.92%)・・・・海水程度の塩味

    中度好塩菌:
    増殖最適NaCl濃度 0.5-2.5 M (2.92-14.6%)・・・・この分類幅広すぎ

    高度好塩菌:
    増殖最適NaCl濃度 2.5-5.2 M (14.6-30.4%)・・・・神の領域

    加えました。これで女性にモテモテですね。

★「塩を入れ忘れた培地は問題外、高知コアセンターで作った培地は、高知から横須賀に運んできた分、少し乾燥が進んでいる。」やべえ。フイタ。

    この場面の台詞を使いたくて、無理矢理ぶっ込みました。
    この部分が一番時間を割いた気がします。

★まさか研究内容紹介記事連載を「ネタ披露場」と
みんな勘違いしてないよね?よね?!

    世の皆様にわかりやすくするために若干のネタ知識を使っただけです。

★好塩菌=病原菌説はどうなったのでしょうか?

    高井さんはパンドラの箱を開けてしまいましたね。
    これだけは秘密にしておきたかったのですが、
    実は、自分の身体を使って実験中だったのです。
    研究対象として好塩菌を選び、常に多くの好塩菌に触れることで感染し、
    その病原性を確認しようとしています。
    恐らく日本、いや世界で最も多くの種に触れているのはこの私でしょう。
    これ以上物忘れがひどくなり、アホになったら調べ時ですよ、高井さん。

    詳しくはこの論文を見て下さい。

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