１ナノグラム以下のセルロースの分解を定量可能なナノテク計測技術を開発
− 先端計測とインフォマティクスにより深海微生物の新たな有用性を明らかに −

1. 発表のポイント

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1ナノグラム（１グラムの10億分の1）以下の極微量のセルロースの酵素分解を超高感度に可視化・定量できる先端ナノ計測技術（Surface Pitting Observation Technology, SPOT）を開発した。

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SPOTとバイオインフォマティクスを組み合わせた解析によって、新規な酵素を使ってセルロースを分解する未知のバクテリアが深海に多数生息していることを発見した。

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陸から海へと運ばれたセルロースのかなりの部分が最終的に深海へとたどり着き、生態系を養っていることが示唆された。

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バイオマス原料からのファインケミカル生産やケミカルリサイクルによるプラスチックの資源循環など、持続可能性の実現に向けた重要課題の解決に役立つことが期待される成果。

2. 概要

地球上で最も豊富なバイオマスであるセルロースの酵素分解プロセスの利活用は、バイオマス原料からのファインケミカル生産など、カーボンニュートラルやSDGsの達成に必要不可欠です。しかしながら水に溶けないセルロースの分解速度は非常に遅く、反応の計測・解析が研究開発を進める上での大きなボトルネックになっていました。

国立研究開発法人海洋研究開発機構（理事長　大和 裕幸、以下「JAMSTEC」という。）海洋機能利用部門　生命理工学センターの出口 茂センター長らは、セルロースの酵素分解を超高感度に可視化・定量できる先端ナノ計測技術「SPOT」（Surface Pitting Observation Technology）を開発しました。SPOTとバイオインフォマティクスを組み合わせた研究によって、深海に生息する微生物が新規なセルロース分解酵素の探索に向けた有望なバイオリソースであることを明らかにしました。

本成果は、Cell Pressが発行する学術誌「iScience」に2022年7月30日付（日本時間）でオンライン掲載されました。

タイトル：

An Ultrasensitive Nanofiber-Based Assay for the Enzymatic Hydrolysis and Deep-Sea Microbial Degradation of Cellulose

著者：

津留美紀子¹、立岡美夏子¹、宮崎征行²、内村康介¹、津田美和子²、高木善弘²、出口茂¹

1. 海洋研究開発機構　海洋機能利用部門　生命理工学センター、2. 海洋研究開発機構　超先鋭研究部門　超先鋭研究開発プログラム

DOI：

10.1016/j.isci.2022.104732（オープンアクセス）

3. 背景

セルロース（植物細胞壁の主成分）は年間約1,000億トンが生産される地球上に最も豊富に存在するバイオマスです。微生物の酵素によるセルロースの分解は、地球上の炭素循環で重要な役割を果たしているだけでなく、バイオマスを原料とした化成品の製造における基幹技術でもあります。しかしながら通常の水に溶ける物質に作用する酵素反応とは異なり、水に溶けないセルロースの酵素反応では酵素が作用できるのは基質表面に限定されるため、分解速度が非常に遅く、反応の計測・解析が研究開発を進める上での大きなボトルネックになっていました。

出口センター長らは、これまでに、直径が20ナノメートル程度の微細なセルロースファイバーの３次元ネットワークからなるゲル（セルロースナノファイバーゲル、図1）を担体として、高温、強酸性、強アルカリ性などの極限環境に生息する微生物を培養する技術の研究を行なってきました。今回の研究ではナノファイバーゲルを利用したセルロース分解の超高感度な可視化計測に取り組みました。

4. 成果

インクジェット微量分注装置を用いてセルロースナノファイバーゲルの表面に数十ピコリットルのセルロース分解酵素（セルラーゼ）水溶液を滴下したところ、ナノファイバー状のセルロースが速やかに酵素分解されて3次元ネットワークが破壊され、ゲル表面に凹みを形成しました（図2）。3D顕微鏡を用いて精密測定した凹みの体積から分解されたセルロースの重量を見積もったところ、1ナノグラム（1グラムの10億分の1）以下という極微量のセルロースの酵素加水分解を定量分析できることがわかりました。

次にセルロースナノファイバーゲルの表面でセルロースを分解できる微生物を培養したところ、増殖とともに細胞外に放出されたセルラーゼによってセルロースナノファイバーが分解され、酵素溶液を滴下した時と同様の凹みを生じました。培養時間の経過とともに凹みは成長し、最終的には目視で確認できるサイズの凹みが形成されました。つまりセルロースナノファイバーゲルの表面で微生物を培養することで、「凹み形成の有無」という極めて簡便な指標により微生物のセルロース分解能力の有無を超高感度に判別できるようになりました。

SPOTと命名した新手法の有用性を実証するために、深海環境からセルロースを分解する微生物の分離を試みました。太陽光が届かない200メートル以深の深海では光合成によるセルロース生産は起こりません。ところが有人潜水調査船「しんかい6500」などを用いた野間岬沖、錦江湾、南海トラフ、沖縄トラフでの調査では（図3左）、いずれの地点からもセルロース分解能を有する微生物を単離することに成功しました。多くが新種と考えられる、これまで存在すら知られていなかった新奇な生物でした（図4）。従来技術ではセルロース分解能を有する微生物の存在を確認できなかったことから、SPOTによるセルロース分解菌をターゲットにした機能スクリーニングの優位性が明らかとなりました。また深海に長期間設置したセルロースゲルが1年後には完全に分解されていたことから、実際の深海環境で微生物によるセルロース分解が起こっていることも確認できました（図3右）。

さらに研究グループでは大量培養に成功したGE09株が持つセルロース分解酵素のバイオインフォマティクス解析を行ない、本菌のゲノム上に陸上微生物由来のセルラーゼなどとは系統的に大きく異なるユニークなセルラーゼを多数見出しました。Google傘下のAI企業DeepMindが開発した機械学習モデル「AlphaFold2」を用いて深海微生物由来のセルラーゼの3次元構造予測を行なったところ、陸上微生物由来のセルラーゼには見られない付加的なループ構造によって触媒中心付近が特異的な構造をとることも示唆されました（図5）。陸上とはかけ離れた深海の極限環境に生息する微生物が、固有のセルロース分解メカニズムを発達させた有用な生物資源であることが明らかとなりました。

海洋環境に最も豊富に存在する有機高分子は主としてカイアシ類などの甲殻類によって推定で年間100~1,000万トンが生産されるキチンだと考えられてきました。ところが、近年、海洋プラスチック汚染への関心の高まりとともに陸域から海洋へと流入するプラスチック量の調査が進んだ結果、キチンの推定生産量に匹敵する1,000万トンにも上るプラスチックが海に毎年流入し、その99パーセント以上が深海に到達していることがわかってきました。陸上でのセルロースの生産量（1,000億トン）はプラスチックの生産量（1億トン）を遥かに凌駕しています。今回の結果は、陸域から海へと流入したセルロースの多くが深海へと到達し、深海の微生物生態系を支える重要な役割を果たしている可能性を強く示唆しています。

水に溶けない物質の酵素分解を高感度に分析する手法は、バイオマスからの化成品製造以外にも持続可能性の実現に向けた様々な研究開発に必要です。例えばプラスチック資源循環の実現に向けてポリエチレンテレフタラート（PET）などのプラスチックを分解する酵素が世界的に大きな注目を集めていますが、ここでも水に溶けないプラスチックの酵素分解を高感度に計測する技術が重要です。今回の研究成果は、持続可能性の達成に向けた様々な技術課題の解決において、ナノテク先端計測とインフォマティクスとの融合など、分野の垣根を超えた学際的取り組みの重要性を示すものです。

5. 今後の展望

難分解性のセルロースを効率的に酵素分解する技術は未だ発展途上にあり、効率的なバイオマス利用の実現に向けた技術的ブレイクスルーが求められています。本研究により深海に生息する微生物が、陸上微生物由来の既知酵素と全く異なる特徴を持つセルラーゼの探索に適した有望な生物資源であることが明らかとなりました。今回の博物学的な発見を契機として、今後は圧力への応答なども含めた深海で独自に進化したセルロース分解の生化学的メカニズムの解明を進めると共に、オープンイノベーション体制による成果の社会実装にも取り組んでいきます。

本研究で開発した「SPOT」は、国立研究開発法人科学技術振興機構（理事長　橋本 和仁）が進める戦略的創造研究推進事業（CREST）研究領域「分解・劣化・安定化の精密材料科学」（研究統括　高原 淳（九州大学 特任教授））の採択課題として進めている「バロポリエステル：圧力による精密分解制御」（研究代表者　出口 茂　JAMSTEC 生命理工学センター長）におけるプラスチック資源循環の実現に向けた研究開発でも活用していきます。

本研究はJAMSTEC生命理工学センター 新機能開拓研究グループ（グループリーダー　出口　茂）で進めている深海の極限環境に発想を得た「深海インスパイヤード化学」に関する研究の一環です。深海底で湧き出す温泉（深海熱水噴出孔）で見られる特異な物理化学プロセスに発想を得た超分子ナノ乳化技術「MAGIQ^®」（2013年5月14日既報、2016年１月19日既報、2016年10月3日既報、2017年8月1日既報、2017年9月25日既報）は、すでに様々な産業分野での実用化に向けた取り組みを進めています。同グループでは今後、「深海バイオインパイヤード化学」をコアシーズに、オープンイノベーション体制による課題解決型の研究開発によって新たな社会的価値を共創することを目指した拠点形成を進めていく予定です。その第一弾として、2022年5月にJAMSTEC初となるサテライトラボを横浜金沢ハイテクセンター・テクノコア（神奈川県横浜市金沢区福浦1－1－1）に設置しています。

本研究の一部はMEXT科研費JP25120512、JSPS科研費JP25850127、JP26850226、JP19K15956、島津科学技術振興財団、国際科学技術財団、極東製薬工業株式会社の支援を受けて行われました。

セルロースナノファイバーゲルを用いた微生物培養技術は、極東製薬工業株式会社より世界初のセルロースを培養基材とした新しい微生物培養ツール「EXedia® セルロースプレート」として2011年に上市されています。